CD79A Linker Optimization

Progress

Cloning	Transfection	Induction	Cytometry	Data Analysis

Plate map

Plate 1

WELL 1

HEK293

WELL 2

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

hEF1a:CD79A-15TCS15-G4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

Dox x uM

WELL 3

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:mKate

hEF1a:CD79A-15TCS15-G4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

Dox x uM

WELL 4

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

hEF1a:mKate

hEF1a:CD79A

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

Dox x uM

WELL 5

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-15TCS15-G4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk

Dox x uM

WELL 6

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

Dox x uM

WELL 7

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

hEF1a:GAl4VP16

Dox x uM

WELL 13

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-3tcs3-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

WELL 14

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-3tcs3-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

WELL 15

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-3tcs15-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

WELL 16

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-3tcs15-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

WELL 17

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-9tcs9-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

WELL 18

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-9tcs9-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

WELL 19

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-3tcs15-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

WELL 20

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-3tcs15-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

WELL 21

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-15tcs15-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

WELL 22

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-15tcs15-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-3-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

Plate 2

WELL 25

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

WELL 26

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXc-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

WELL 27

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

WELL 28

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXc-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

WELL 29

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

WELL 30

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXc-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

WELL 31

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

WELL 32

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXc-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

WELL 33

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

WELL 34

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXc-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

WELL 35

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

WELL 36

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

Plate 3

HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM	HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM	HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM
HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM	HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM	HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM
HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM	HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM	HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM
HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM	HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM	HEK293 hEF1a:rtTA hEF1a:MabH hEF1a:MabL hEF1a:Lyn hEF1a:eBFP UAS:mKate hEF1a:CD79A-XnTCSXx-Gal4VP16 hEF1a:CD79B TRE:Syk-Xs-tTEVp dox x uM

Background

The BCR setup that we used in iGEM (CD79X-TCS-Gal4VP16 and Syk-15-TEVp) resulted in an inverted signal i.e. lower output when the BCR was activated with antiIgM than when unactivated. We expect that this inverted signal was a result of how fusing proteins to TEVp and TCS affected the sterics of their interaction. We think that when Syk was recruited to the activated BCR, it was no longer able to access the TCS, resulting in lower signal than background. This experiment aims to optimize the relative positions of the system's components by finding the optimal fusion protein linker lengths. We want to find the optimal length of the CD79-XnTCSXc-Gal4VP16 linker (where Xn and Xc are the number of amino acids of the n terminal and c terminal side of the TCS, respectively) and the Syk-TEVp linker. Optimizing 3 factors simultaneously gives a 3D search space as shown below. We chose data points in a way that maximized the space explored in the least number of points.

Approach

For ease of screening to identify correct linker constructs, we want to clone Protein1-pTet:mRFP-Protein2 constructs.

Parts

Part	h:CA-pT:RFP-G4	h:CA-pT:RFP-G4	TRE:Syk-pT:RFP-G4
Status		Need SDM to correct point mutation

Part	hEF1a:Heavy	hEF1a:Light	UAS:mKate
Status

hEF1a:CD79A-XnTCSXc-Gal4VP16

3TCS3		9TCS3		15TCS3

	6TCS6	9TCS6	12TCS6

3TCS9	6TCS9	9TCS9	12TCS9	15TCS9

	6TCS12	9TCS12	12TCS12

3TCS15		9TCS15		15TCS15

TRE:Syk-X-tTEVp

3	6	9	12	15

Experiment

Controls

Untransfected

Single Color Blue

Single Color Red

Double Color

-VE control (background activation)

-VE control (background cleavage)

+VE control

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

hEF1a:CD79A-15TCS15-G4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

Dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:mKate

hEF1a:CD79A-15TCS15-G4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

Dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

hEF1a:mKate

hEF1a:CD79A-15TCS15-G4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

Dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

Dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-15TCS15-G4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk

Dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-15-tTEVp

hEF1a:GAl4VP16

Dox x uM

* Maximum linker lengths were used in controls to evaluate the maximum background activation (CD79A-15TCS15-Gal4VP16) and maximum background cleavage (Syk-15-tTEVp)

Experimental Conditions

- anti IgM

+ anti IgM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXc-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

HEK293

hEF1a:rtTA

hEF1a:MabH

hEF1a:MabL

hEF1a:Lyn

hEF1a:eBFP

UAS:mKate

hEF1a:CD79A-XnTCSXc-Gal4VP16

hEF1a:CD79B

TRE:Syk-Xs-tTEVp

dox x uM

anti IgM x uM

Xs	XnTCSXc
S3	3tcs3, 3tcs15, 9tcs9, 15tcs3, 15tcs15
S6	6tcs6, 6tcs12, 9tcs9, 12tcs6, 12tcs12
S9	3tcs9, 6tcs9, 9tcs3, 9tcs6, 9tcs9, 9tcs12, 9tcs15, 12tcs9, 15tcs9
S12	6tcs6, 6tcs12, 9tcs9, 12tcs6, 12tcs12
S15	3tcs3, 3tcs15, 9tcs9, 15tcs3, 15tcs15

Child pages

Progress

Background

Approach

Parts

Part

Status

Part

Status

Experiment

Results

Discussion